张玉霞教授（第二排左五）和她的团队
论文链接
https://doi.org/10.1038/s41392-023-01631-0
1、新冠病毒进入宿主细胞的过程
促进了ACE2蛋白降解
研究团队首先发现了在新冠病毒侵染人结肠腺癌（Caco-2）细胞和稳定表达ACE2蛋白的293T（ACE2-293T）细胞的过程中，新冠病毒棘突蛋白的降解和ACE2的降解随时间增加而加强，使用新冠病毒假病毒感染ACE2-293T细胞实验获得类似结果。
此外，野生型、德尔塔和奥密克戎型新冠假病毒在侵染293T细胞时同样观察到类似的现象。说明ACE2的降解是不同新冠病毒亚型感染过程的一个共同机制。
此过程中ACE2的mRNA水平保持不变，表明ACE2分子水平下降是由蛋白质降解所致。这些结果证实了新冠病毒感染可导致ACE2蛋白水平降低，这一现象由病毒的活性而非毒株特异性所致。
研究团队在病毒侵染细胞实验中使用了TMPRSS2和内吞作用抑制剂测试ACE2的降解情况，发现膜融合和内吞作用可促进ACE2的降解。
2、新冠病毒棘突蛋白介导
ACE2的内吞和降解
为研究棘突蛋白与ACE2的相互作用是否促进了ACE2的内吞和降解，研究人员使用小鼠Fc融合的棘突蛋白受体结合区蛋白（RBD-Fc）刺激ACE2-293T细胞。
结果发现RBD-Fc呈浓度依赖性促进ACE2的降解，使用中和抗体阻断ACE2与刺突蛋白的结合可阻止ACE2的细胞内吞和降解。
通过构建与棘突蛋白亲和力不同的ACE2蛋白，如结合力较低的鼠ACE2（mACE2）和人ACE2 K31R突变体，研究人员发现以上两种ACE2异构体在RBD-Fc的刺激下降解减少。
通过荧光显微镜发现RBD-Fc-ACE2从细胞膜通过内吞作用进入细胞质，ACE2与早期内体标志物ACE2共定位。这些数据表明棘突蛋白受体结合区可诱导ACE2的内吞和降解，ACE2-棘突蛋白相互作用是ACE2降解的关键。
3、自噬-溶酶体信号途径
介导ACE2-棘突蛋白复合物降解
棘突蛋白如何促进ACE2降解具体机制尚未明确，研究人员首先在293T细胞中使用全长和胞外结合区（aa. 1-611）ACE2蛋白进行实验，发现两者均可被棘突蛋白诱导降解。
于是研究人员进一步使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）、氯喹（CQ）、巴佛洛霉素A1（BafA1）、蛋白酶抑制剂MG132抑制RBD-Fc诱导ACE2降解。结果发现3-MA、CQ和BafA1可显著抑制ACE2的降解但MG132无该效果。
在细胞系中敲低自噬相关基因ATG5和MAP1LC3A同样可抑制ACE2的降解，提示ACE2通过自噬-溶酶体信号途径降解。通过免疫荧光法，研究人员进一步观察到ACE2、刺突蛋白与自噬激活分子LC3B存在共定位，进一步证实自噬途径参与ACE2和刺突蛋白复合物降解过程。
为验证棘突蛋白的侵染是否影响细胞自噬水平，研究人员共孵育RBD-Fc和ACE2-293T细胞，发现该过程中细胞自噬标志物LC3A/ LC3B的比值和p62蛋白水平随孵育时间逐渐降低，提示棘突蛋白在入侵细胞的过程促进了自噬发生。
于是研究人员使用自噬抑制剂3-MA和CQ、自噬激活剂雷帕霉素处理新冠假病毒感染的细胞，结果发现通过3-MA和CQ抑制自噬可显著降低病毒载量，反之雷帕霉素的处理显著增加病毒的载量，证实了ACE2和刺突蛋白通过自噬途径在胞内降解。
此外，ACE2可以抑制棘突蛋白的选择性切割。此切割选择性是病毒入侵的重要步骤，实验发现只有CQ可以抑制选择性切割，由于CQ特异性抑制溶酶体酸化，因此可知刺突蛋白的选择性切割不依赖于自噬体的作用而是依赖于溶酶体的作用。
4、新冠病毒在网格蛋白介导下
发生内吞作用进入细胞
胞吞过程包括网格蛋白介导的胞吞作用、小窝蛋白介导的胞吞作用和巨胞饮三种途径。为确定新冠病毒通过何种途径进入细胞，研究人员使用了三种途径的特异性抑制剂dynasore（特异性抑制网格蛋白内吞作用）、nystatin（特异性抑制小窝蛋白介导的胞吞）和blebbistatin（特异性抑制巨胞饮）进行抑制实验。
结果发现dynasore通过抑制网格蛋白内吞作用途径能显著抑制病毒的入侵，同时dynasore可显著抑制RBD-Fc和ACE2的内吞。
因此研究人员进一步选择了其他网格蛋白抑制剂重复实验，发现这些抑制剂具有类似的效果。网格蛋白介导内吞过程的相关基因（CLTC、DMN1和DMN2）是此过程的关键基因，使用siRNA敲低上述基因，假病毒进入细胞的效率显著降低。
由于病毒通过细胞内吞作用进入胞内还依赖于细胞骨架重排作用，研究人员使用抑制细胞骨架重排抑制剂细胞松弛素D（Cytochalasin D）进行实验，结果显示细胞松弛素D具有抑制假病毒进入细胞的效果。
同时使用dynasore和细胞松弛素D可将病毒入胞的效率限制至10-20%。通过流式细胞术发现同时使用两种抑制剂可显著阻止ACE2的降解。
因此，上述结果说明网格蛋白介导的内吞作用和细胞骨架重排介导新冠病毒进入细胞。
5、PAK1介导的细胞骨架重排
促进病毒进入细胞
PAK1特异性激活细胞骨架重排，能促进多种病毒（牛痘病毒、非洲猪瘟病毒和呼吸道合胞病毒）的内吞。研究人员发现PAK1也是促进新冠病毒内吞和感染细胞的重要分子，敲低PAK1可维持ACE2的表达并抑制RBD-Fc进入细胞。
通过测定Ser144和Thr423位点的磷酸化，进一步确认了PAK1在RBD-Fc进入细胞过程中激活。为进一步研究PAK1通过何种信号途径激活，研究人员将经典的PAK1激活通路EGFR/RAC1/CDC42上的关键分子RAC1和CDC42进行沉默实验，结果发现ACE2的表达未有显著改变，说明PAK1并非通过此通路活化。
有报道指CK2α分子促进RAC1/CDC42非依赖性PAK1激活，此外有研究提示CK2α在新冠病毒感染过程中被激活。因此研究人员在细胞系中敲低了CK2α分子，发现该操作显著降低PAK1的活化，ACE2的水平恢复。
因此，研究人员最终选择了泛PAK1抑制剂FRAX-486和CK2α抑制剂silmitasertib进行抑制实验，发现两种抑制剂均可阻断新冠假病毒的入胞和RBD-Fc介导的ACE2降解。
6、FRAX-486在体内与体外实验中
显示抗新冠病毒活性
研究人员利用体外实验比较了FRAX-486和silmitasertib的抑制病毒RNA复制活性，发现FRAX-486的抑制活性更高。
于是通过新冠活病毒进行体外和体内实验进一步测定FRAX-486的抗病毒作用。在新冠活病毒感染细胞实验室中，FRAX-486表现出浓度依赖性的抗病毒作用，IC50约为1.25 μM，可显示降低病毒滴度、病毒RNA的复制、病毒蛋白量和PAK1的磷酸化，并且对德尔塔和奥密克戎病毒亚株同样具有抑制效果。
因此，研究人员使用叙利亚仓鼠建立新冠感染模型评估FRAX-486的体内抗病毒活性。结果显示FRAX-486具有与阳性对照3CL蛋白酶抑制剂GC376等效的抗新冠病毒效果。
FRAX-486干预组仓鼠肺部病毒RNA水平及病毒滴度显著降低，肺部炎症浸润和出血情况显著改善。上述结果说明了泛PAK抑制剂FRAX-486是一种新型靶向宿主的治疗新型冠状病毒肺炎的候选药物分子。
结论
综上，本研究结果发现了新冠病毒进入细胞的一种新途径，同时有针对性地设计了治疗新冠病毒感染的新靶点，并在动物水平上验证了可用于治疗新冠病毒感染的候选化合物，为新冠病毒的防治提供了新的思路。
PAK1促进冠病毒入侵细胞和ACE2降解，
PAK1抑制剂有广谱抗新冠病毒活性。
a, PAK1抑制剂FRAX-486阻断SARS-CoV-2假病毒变异体（野生型、Delta和Omicron）进入ACE2-293T和Caco-2细胞。b, FRAX-486治疗SARS-CoV-2感染的叙利亚仓鼠模型的体内效果评估示意图。c-e, FRAX-486降低SARS-CoV-2感染仓鼠肺部的SARS-CoV-2 RNA载量 (c), 病毒滴度（d），降低肺部免疫浸润（e）。GC376和PBS分别为阳性对照和阴性对照药物。
本研究获得了国家自然科学基金项目（批准号：82000007、82001676、 91842304、82125015、82272337），广东省基础与应用基础研究基金联合基金（批准号：202102020194），广东省钟南山医学基金会（批准号：2020013），香港优配研究金（批准号：17122322）等项目的资助。
P21蛋白激活激酶1（PAK1）介导的
细胞骨架重排促进新冠病毒入侵
细胞和ACE2的自噬降解
END
来源：儿科研究所
编辑：李雯
审核：周密 谭炳科
审定发布：陈晓怡返回搜狐，查看更多